66.96.147.114Region MetropolitanaSantiagoMicrobiologia / Lunes 7 de Septiembre del a�o 2009 / 21:29 Horas.
Transformación
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Bacteriologí­a

Genética bacteriana > Transformación

La transformación es un proceso de transferencia de genes en donde la célula bacteriana capta DNA desnudo a partir del medio, lo incorpora y expresa. Para que la célula pueda captar el DNA desnudo debe encontrarse en estado de "competencia". El estado de "competencia" ocurre naturalmente en algunos microorganismos, competencia fisiológica, y puede ser inducido artificialmente en otros, competencia artificial. El DNA exógeno internalizado puede integrarse mediante recombinación al cromosoma o a un plásmido, o puede establecerse como un replicón autónomo si contiene un origen de replicación y puede circularizarse.





Desarrollo de la competencia y unión del DNA transformante


Procesado y toma del DNA exógeno

Proteí­nas especí­ficas se unen y protegen al DNA exógeno monocatenario

El DNA exógeno se integra al cromosoma bacteriano en regiones homólogas por medio de la proteí­na RecA

La transformación puede dividirse en diferentes etapas que son comunes a todas las bacterias:

  1. Desarrollo de la competencia
  2. Unión del DNA
  3. Procesado y captación del DNA
  4. Integración del DNA por recombinación y expresión

Desarrollo de la competencia: La "competencia" requiere complejos cambios fisiológicos que ocurren en determinadas etapas de crecimiento y está asociada a diversos fenómenos en distintas especies de bacterias. En Streptococcus pneumoniae se ha descrito que el estado de "competencia" se logra cuando se alcanza cierta densidad celular crí­tica durante la fase de crecimiento exponencial y una concentración efectiva de una proteí­na extracelular, a menudo denominada factor de competencia FC, que induce la sí­ntesis de ciertas proteí­nas involucradas en el proceso de transformación. Este factor de competencia liberado por algunas células inducen la competencia de las restantes células presentes en el cultivo. Durante este estado las células además liberan al medio autolisinas que desenmascaran el sitio de unión y captación del DNA. En Bacillus subtilis la competencia se produce durante la fase estacionaria cuando la sí­ntesis de ácidos nucleicos está disminuí­da. En Haemophilus spp. la competencia está asociada a células que no se dividen. Y en Neisseria gonorrhoeae, la competencia está relacionada con la presencia de pilis, ya que las células con pilis son naturalmente competentes mientras que las células sin pilis son incapaces de alcanzar la competencia.

En ciertas especies de bacterias se puede inducir la "competencia" por mecanismos artificiales debido a que son incapaces de alcanzar este estado naturalmente. En uno de ellos, las bacterias son colocadas en soluciones de CaCl2 (Cloruro de Calcio) que por mecanismos desconocidos permiten la absorción y captación de DNA exógeno. Otro mecanismo es la electroporación, en la que por medio de pulsos eléctricos se abren pequeños poros en las bacterias por los cuales ingresa el DNA exógeno.

Unión del DNA: La célula une mediante un receptor que se encuentra en su superficie principalmente DNA doble cadena aunque pueden unir limitadas cantidades de DNA simple cadena. La especificidad del DNA que la célula puede unir varí­a con la especie bacteriana. Las bacterias Gram positivas como el Streptococcus pneumoniae y el Bacillus subtilis pueden unir cualquier tipo de DNA doble cadena que este presente en el medio. Esto significa que pueden unir tanto DNA homólogo como heterólogo. En cambio, las bacterias Gram negativas como el Haemophilus y Neisseria spp. sólo pueden unir DNA homólogo o de especies muy semejantes. Por ejemplo, en Haemophilus la internalización del DNA requiere una secuencia especí­fica de 11 pares de bases (5'-AAGTGCGGTCA-3'), la que se encuentra repetida 600 veces en su genoma.

La unión del DNA transformante involucra una primera fijación reversible que luego se transforma en irreversible. Durante la fijación de tipo irreversible el DNA no puede soltarse ni reemplazarse.

Procesado y captación del DNA: Una vez que el DNA doble cadena se ha fijado irreversiblemente a la célula sufre diversos procesos que llevan a la captación de una de las cadenas del DNA. En las bacterias Gram positivas el DNA doble cadena unido es nickeado (ruptura del enlace fosfodiéster entre dos nucleósidos de una misma cadena) por una proteí­na que se cree forma parte del receptor del DNA. Este receptor empuja la cadena complementaria hacia el interior de la célula y la cadena nickeada es degradada a oligonugleótidos por una endonucleasa asociada. De esta manera, sólo ingresa a la célula una de las cadenas del DNA originalmente unido. En esta etapa, el DNA simple cadena internalizado se encuentra en una etapa de eclipse, ya que ha perdido la capacidad de servir como DNA "donante" para una nueva transformación porque el DNA simple cadena es unido y captado en forma muy pobre por células competentes. El DNA simple cadena captado es protegido de la acción de endonuclesas por su asociación a proteí­nas SSB especí­ficas de la competencia, y forma un complejo de eclipse. En las bacterias Gram negativas, el DNA doble cadena especí­fico que se ha unido es tomado por unas vesí­culas denominadas transformasonas. Dentro de estas vesí­culas una de las cadenas es degradada y la otra es internalizada por un proceso similar al del pneumococo. Sin embargo, en bacterias como Haemophilus no se han observado intermediarios DNA simple cadena en el citoplasma y por lo tanto hay ausencia de DNA en eclipse. Los transformasomas protegen al DNA de las DNasas externas y de las enzimas de restricción celulares.

Integración del DNA por recombinación y expresión: En Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis y Haemophilus influenzae los DNAs donante y receptor forman un producto que es DNA heterodúplex. La integración del complejo DNA simple cadena-proteí­nas SSB a regiones homólogas del cromosoma es muy rápida en Streptococcus pneumoniae y está mediada por recombinasas como la RecA. Sin embargo el DNA que no contiene homologí­a es degradado por nucleasas celulares. En las bacterias como el Haemophilus el DNA simple cadena se integra al cromosoma en regiones homólogas por recombinación a medida que ingresa a la célula desde los transformasomas.


Captación del DNA durante la transformación en una bacteria Gram positiva




Captación del DNA durante la transformación en una bacteria Gram negativa
mediada por los transformasomas



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